熱門搜索：低溫冰箱、生化培養(yǎng)箱、鼓風(fēng)干燥箱、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、箱式電阻爐、電子天平、滅菌器等等實(shí)驗(yàn)設(shè)備
avigation
1. 學(xué)習(xí)與掌握親和層析和凝膠層析分離的一般原理和操作方法。
2. 了解自動(dòng)化純化設(shè)備基本組成和原理。
3. 了解親和吸附層析瓊脂糖、凝膠過(guò)濾葡聚糖的基本性質(zhì)。掌握組氨酸標(biāo)簽蛋白的基本性質(zhì)和純化原理和操作；掌握緩沖液置換和脫鹽的原理和操作。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 樣品預(yù)處理：即通過(guò)超聲這種細(xì)胞破碎的手段，將在大腸桿菌E.coli中表達(dá)的重組的帶6個(gè)His標(biāo)簽的綠色熒光蛋白釋放到相應(yīng)的緩沖液當(dāng)中，再通過(guò)離心，0.2微米濾膜過(guò)濾等去除細(xì)胞碎片和別的污染物；
2. 組氨酸標(biāo)簽蛋白親和層析：HisTrapTMHP crude, 1mL預(yù)裝層析柱，進(jìn)行親和層析，一步就可以達(dá)到90%左右的純度
3. 凝膠過(guò)濾層析脫鹽去除咪唑：HiTrapTM Desalting 5mL預(yù)裝層析柱進(jìn)行脫鹽，置換緩沖液
4. 電泳：對(duì)純化過(guò)的樣品的檢測(cè)。
三、設(shè)備以及試劑準(zhǔn)備（試劑均使用化學(xué)純以上）：
1. 儀器：核酸蛋白檢測(cè)儀HD系列、自動(dòng)部分收集器BSZ\DBS系列、恒流泵HL系列
2. 樣品：EGFP原液
3. 層析柱：HisTrap HP 1ml, 1根；HiTrap Desalting 5ml，1根
4. 層析緩沖液
名稱 | 配方 | 體積 |
緩沖液A 親和結(jié)合緩沖液 脫鹽平衡和洗脫緩沖液 | 25mM 磷酸鹽緩沖液,150mM NaCl, 20mM 咪唑,pH7.4 | 250ml |
緩沖液B 親和洗脫緩沖液 | 25mM 磷酸鹽緩沖液,150mM NaCl, 500mM 咪唑,pH7.4 | 100ml |
去離子水 | 脫氣或負(fù)壓脫氣 | 500ml |
層析柱保存緩沖液 | 20%乙醇 |
5. 注射器，燒杯，負(fù)壓脫氣瓶等實(shí)驗(yàn)室常用容器
1. 儀器和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
所有緩沖液需要過(guò)0.2um膜過(guò)濾，負(fù)壓脫氣抽濾瓶脫氣，脫氣裝置如圖所示
樣品預(yù)處理：即通過(guò)超聲這種細(xì)胞破碎的手段，將在大腸桿菌E.coli中表達(dá)的重組的帶6個(gè)His標(biāo)簽的綠色熒光蛋白釋放到相應(yīng)的緩沖液當(dāng)中，再通過(guò)離心，0.45 微米濾膜過(guò)濾等去除細(xì)胞碎片和別的污染物；用注射器吸取大于2ml樣品
將注射器內(nèi)的樣品從樣品環(huán)3號(hào)口推入，注意不要將氣泡推入樣品環(huán)(如右圖)。
